冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.004

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (32): 5765-5771.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.32.004

• 脐带脐血干细胞 umbilical cord blood stem cells • 上一篇下一篇

冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较

常相萍¹，马艳²，毕晓娟²，宋丽娟¹，段显琳¹，江明^1，2

1新疆医科大学第一附属医院血液二科、新疆血液病研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011
2新疆医科大学临床医学研究院干细胞研究中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2013-04-05 修回日期:2013-06-01 出版日期:2013-08-06 发布日期:2013-08-06
通讯作者: 江明，硕士，主任医师，教授，博士生导师，新疆医科大学第一附属医院血液二科、新疆血液病研究所，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830011；新疆医科大学临床医学研究院干细胞研究中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 jiangmingyy@126.com
作者简介:常相萍★，女，1982年生，山东省菏泽市人，汉族，2008年安徽理工大学医学院毕业，在读硕士，主要从事造血干细胞移植、血液病的研究。
基金资助:
新疆医科大学第一附属医院干细胞专项基金(2009-GXB-07)。

Human umbilical cord mesenchymal stem cells: Comparison of hematopoiesis supporting capacity before and after cryopreservation

Chang Xiang-ping¹, Ma Yan², Bi Xiao-juan², Song Li-juan¹, Duan Xian-lin¹, Jiang Ming^{1, 2}

1Second Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Institute of Hematology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
2Stem Cell Laboratory, Clinical Medicine Research Institute of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2013-04-05 Revised:2013-06-01 Online:2013-08-06 Published:2013-08-06
Contact: Jiang Ming, Master, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Second Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Institute of Hematology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; Stem Cell Laboratory, Clinical Medicine Research Institute of the Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China jiangmingyy@126.com
About author:Chang Xiang-ping★, Studying for master’s degree, Second Department of Hematology, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Institute of Hematology of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
Special Fund for Stem Cells in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, No. 2009-GXB-07*

摘要/Abstract

摘要：

背景：低温冻存脐带间充质干细胞已成为研究热点，但关于冻存后其造血支持能力变化的报道甚少。
目的：比较冷冻前后脐带间充质干细胞体外支持成人骨髓单个核细胞造血集落生成的能力。
方法：分别将冷冻前后的人脐带间充质干细胞和人骨髓来源的间充质干细胞培养至第3代，经2.5 g/L丝裂霉素C处理制备为细胞滋养层，与成人异体骨髓单个核细胞共培养。体外培养至35 d 应用甲基纤维素法检测造血干/祖细胞集落的增殖状态。
结果与结论：冷冻人脐带间充质干细胞组集落形态、大小上与骨髓间充质干细胞组和未冷冻人脐带间充质干细胞组相似，3者均比空白组集落数量多，差异有显著性意义(P < 0.05)。与未冷冻人脐带间充质干细胞组相比，冷冻人脐带间充质干细胞组集落数更少，差异有显著性意义(P < 0.05)。实验结果说明冷冻前后人脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对骨髓单个核细胞均有造血刺激作用，但人脐带间充质干细胞冷冻后的造血支持作用有所减弱。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, 冷冻, 共培养, 造血, 长期培养起始细胞, 造血干/祖细胞, 造血集落, 扩增, 其他基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Cryopreservation of human umbilical cord mesenchymal stem cells has been a hot research issue currently, but the studies concerning their effects on expansion of hematopoietic stem/progenitor cells after cryopreservation are seldom.
OBJECTIVE: To investigate the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells before and after cryopreservation as feeder layer on expansion of human bone marrow mononuclear cells in vitro.
METHODS: 2.5g/L mitomycin C processed human umbilical cord mesenchymal stem cells and bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were used as the feeder layer to expand adult allogeneic bone marrow mononuclear cells in culture. Up to day 35, methylcellulose assay was used to detect hematopoietic stem/progenitor cell colony proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no differences in the morphology and size of colonies in the cryopreserved human umbilical cord mesenchymal stem cell group, bone marrow mesenchymal stem cell group and non-cryopreserved human umbilical cord mesenchymal stem cell group. However, these parameter described above were significantly higher in these three groups than the blank control group (P < 0.05). There were fewer colonies in the cryopreserved human umbilical cord mesenchymal stem cell group than the non-cryopreserved human umbilical cord mesenchymal stem cell group (P < 0.05). These findings indicate that human umbilical cord mesenchymal stem cells before and after cryopreservation have the ability as feeder layer on expansion of bone marrow mononuclear cells in vitro similar to bone marrow mesenchymal stem cells. But this ability of human umbilical cord mesenchymal stem cells may decrease after cryopreservation.

Key words: stem cells, umbilical cord/umbilical blood stem cells, human umbilical cord mesenchymal stem cells, cryopreservation, co-culture, hematopoiesis, long-term culture of initiating cells, hematopoietic stem/progenitor cells, hematopoietic colony, amplification, other grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

常相萍，马艳，毕晓娟，宋丽娟，段显琳，江明. 冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(32): 5765-5771.

Chang Xiang-ping, Ma Yan, Bi Xiao-juan, Song Li-juan, Duan Xian-lin, Jiang Ming. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: Comparison of hematopoiesis supporting capacity before and after cryopreservation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(32): 5765-5771.

图/表（结果） 4

2.1 细胞滋养层的形态 见图1。

人脐带间充质干细胞原代培养5-9 d出现散在的双极细胞，约在17 d细胞呈漩涡状生长，汇合达到90%以上传代(图1A)；冻后人脐带间充质干细胞细胞形态无变化(图1B)。人包皮成纤维细胞原代分离培养两三天后见小灶短梭形细胞从组织块中爬出，3 d后可传代P1(图1C)；骨髓间充质干细胞分离培养8-10 d可出现大量梭形细胞，细胞体积大，镜下透亮(图1D)。经丝裂霉素处理后的第3代冷冻前、后脐带间充质干细胞、人包皮成纤维细胞、骨髓间充质干细胞细胞体积变大、变长，并随时间的延长可产生复层。

2.2 骨髓单个核细胞CD34阳性率 流式细胞术检测CD34阳性率发现，共培养前骨髓单个核细胞中CD34⁺细胞所占百分比为0.1%-6.6%，见图2。因此认为研究所用的骨髓单个核细胞含有造血干/祖细胞。

2.3 骨髓单个核细胞与人脐带间充质干细胞共培养后的形态 对共培养体系各组细胞分别进行14，28，35 d的倒置荧光显微镜下观察，结果见图3。

空白组随着时间的延长，骨髓单个核细胞数减少，在8-10 d观察到部分细胞体积变大，并且在14 d左右出现少量散在分布的梭形贴壁细胞，并在28 d左右观察到以梭形细胞为中心，其上散在分布有体积变大、折光性增强的均一性的造血细胞小丛(细胞数<15/集落)。

人包皮成纤维细胞组中，上层细胞散在地附着在滋养层细胞上，并随共培养时间的延长，部分细胞体积稍微变大，无小丛及集落形成。

骨髓间充质干细胞组中，上层细胞六七天部分细胞体积开始变大、折光性增强，散在地附着在骨髓间充质干细胞滋养层细胞上生长，大而亮的细胞随共培养时间延长逐渐增多。在23 d左右，出现少量小丛。

未冷冻人脐带间充质干细胞组中，在7 d左右部分上层细胞形态变大、折光性增强，散在地附着在人脐带间充质干细胞滋养层细胞生长，高倍镜下观察，上层细胞黏附在滋养层细胞密集部位。随着共培养时间的延长，在21 d左右少量细胞聚集成小丛。多数仍大面积散在分布在底层细胞上。

冷冻人脐带间充质干细胞组中，观察结果与未冷冻人脐带间充质干细胞组相似，在共培养初期，细胞团游离现象常见，约7 d后，部分细胞体积逐渐变大、变亮，散在附着在滋养层细胞上，在21 d左右出现少数聚集生长的小丛。各共培养组滋养层细胞在28 d后不同程度地出现胞浆融解、核膜消失、胞核破碎等现象，所以可见到因滋养层细胞卷缩成团而造成的上层附着细胞聚集现象。

2.4 共培养体系经甲基纤维素法培养后的造血集落 不同时间点收获各共培养组上层非滋养层细胞。接种在甲基纤维素中培养14 d，除人包皮成纤维细胞组外4组均有红系集落形成单位、爆式红系集落形成单位、粒细胞巨噬细胞系集落形成单位、混合集落形成单位等典型造血集落，见图4和表1。

随时间推移，各组集落体积变大，数量减少。共培养35 d，冷冻人脐带间充质干细胞组与未冷冻人脐带间充质干细胞组、骨髓间充质干细胞组组成集落的单个细胞体积达到最大，集落以混合集落形成单位为主。空白组中以红系集落形成单位、CFU-G单系为主。冷冻人脐带间充质干细胞组集落形态、大小、数量上与骨髓间充质干细胞组和未冷冻人脐带间充质干细胞组相似，三者均比空白组集落数量多，差异有显著性意义(P < 0.05)。与未冷冻人脐带间充质干细胞组相比，冷冻人脐带间充质干细胞组集落数更少，差异有显著性意义(P < 0.05)。冷冻人脐带间充质干细胞组与骨髓间充质干细胞组相比，集落数的差异无显著性意义(P > 0.05)。

参考文献

[1] Romanov YA, Svintsitskaya VA, Smirnov VN. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSC-like cells from umbilical cord. Stem Cells. 2003;21(1):105-110.

[2] Nishida S, Endo N, Yamagiwa H, et al. Number of osteoprogenitor cells in human bone marrow markedly decreases after skeletal maturation. J Bone Miner Metab. 1999;17(3):171-177.

[3] Robinson SN, Ng J, Niu T, et al. Superior ex vivo cord blood expansion following co-culture with bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Bone Marrow Transp lant. 2006; 37(4):359-366.

[4] Zhang Y, Chai C, Jiang XS, et al. Co-culture of umbilical cord blood CD34+cells with human mesenchymal stem cells. Tissue Eng. 2006;12(8):2161-2170.

[5] 杨平地,黄友章,沈建良,等.脐带血清对造血细胞的增殖刺激作用[J].中国免疫学杂志,2002,18(12):844-846.

[6] De Lima M, McNiece I, Robinson SN, et al. Cord-blood engraftment with ex vivo mesenchymal-cell co-culture. N Engl J Med. 2012;367(24):2305-2315.

[7] Noort WA, Kruisselbrink AB, In’t Anker PS, et al. Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34(+) cells in NOD/SCID mice. Exp Hematol. 2002;30(8):870-878.

[8] Isern J, Martín-Antonio B, Ghazanfari R. Self-renewing human bone marrow mesenspheres promote hematopoietic stem cell expansion. Cell Rep. 2013;3(5):1714-1724.

[9] Zaker F, Nasiri N, Oodi A, et al. Evaluation of umbilical cord blood CD34 (+) hematopoietic stem cell expansion in co-culture with bone marrow mesenchymal stem cells in the presence of TEPA. Hematology. 2013;18(1):39-45.

[10] Rodríguez-Pardo VM, Vernot JP. Mesenchymal stem cells promote a primitive phenotype CD34+c-kit+ in human cord blood-derived hematopoietic stem cells during ex vivo expansion. Cell Mol Biol Lett. 2013;18(1):11-33.

[11] Weiss ML, Anderson C, Medicetty S, et al. Immune properties of human umbilical cord Wharton’s jelly-derived cells. Stem Cells. 2008;26(11):2865-2874.

[12] Luan X, Li G, Wang G, et al. Human placenta-derived mesenchymal stem cells suppress T cell proliferation and support the culture expansion of cord blood CD34? cells: a comparison with human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Tissue Cell. 2013;45(1):32-38.

[13] Mitchell KE, Weiss ML, Mitchell BA, et al. Matrix cells from Wharton’s Jelly form neurons and glia. Stem Cells. 2003;21(1): 50-60.

[14] Hu J, Wang F, Sun R, et al. Effect of combined therapy of human Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells from umbilical cord with sitagliptin in type 2 diabetic rats. Endocrine. in press.

[15] Messerli M, Wagner A, Sager R, et al. Stem Cells From Umbilical Cord Wharton's Jelly From Preterm Birth Have Neuroglial Differentiation Potential. Reprod Sci. in press.

[16] Wu S, Ju GQ, Du T et al. Microvesicles Derived from Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells Attenuate Bladder Tumor Cell Growth In Vitro and In Vivo. PLoS One. 2013;8(4):e61366.

[17] Baba K, Yamazaki Y, Ishiguro M. Osteogenic potential of human umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells cultured with umbilical cord blood-derived fibrin: A preliminary study. J Craniomaxillofac Surg. in press.

[18] Anzalone R, Lo Iacono M, Corrao S, et al. New emerging potentials for human Wharton's jelly mesenchymal stem cells: immunological features and hepatocyte-like differentiative capacity. Stem Cells Dev. 2010;19(4):423-438.

[19] Fong CY, Subramanian A, Biswas A, et al. Derivation efficiency, cell proliferation, freeze-thaw survival, ‘stemness’ properties, and differentiation of human Wharton’s jelly stem cells: their potential for concurrent banking with cord blood for regenerative medicine purposes. Reprod Biomed Online. 2010; 21(3):391-401.

[20] Rahul S, David L, Dolores B, et al. Human Umbilical Cord Perivascular (HUCPV) Cells: A Source of Mesenchymal Progenitors. Stem Cells. 2005;23(2):220-229.

[21] Beshlawy AE, Metwally HG, Khalek KA, et al.The effect of cryopreservation on the recovery and expansion of umbilical cord blood hematopoietic stem cells. Exp Clin Transplant. 2009;7(1):50-55.

[22] Ma Y, Zhang DQ, Chen L, et al. Super paramagnetic iron oxide nanoparticles lable human bone marrow and umbilical cord mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2012;16(45):8398-8405.

[23] Liu Z, Zhu W, Yu Y, et al. Derivation and long term culture of human parthenogenetic embryonic stem cells using human foreskin feeders. J Assist Reprod Genet. 2010;27(6):285- 291.

[24] Majumdar MK, Thiede MA, Haynesworth SE, et al. Human marrow-derived mesenchymal stem cells(MSCs)exp ress hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. J Hematother Stem Cell Res. 2000; 9(6):841-848.

[25] Christodoulou I, Kolisis FN, Papaevangeliou D. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton's Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013;2013:246134.

[26] Anzalone R, Lo Iacono M, Loria T, et al. Wharton’s jelly mesenchymal stem cells as candidates for beta cells regeneration: extending the differentiative and immunomodulatory benefits of adult mesenchymal stem cells for the treatment of type 1 diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 2011;7(2):342-363.

[27] Rocca GL, Anzalone R, Corrao S. et al. Isolation and characterization of Oct-4+/HLA-G+ mesenchymal stem cells from human umbilical cord matrix: differentiation potential and detection of new markers. Histochem Cell Biol. 2009;131(2): 267-282.

[28] Cao FJ, Feng SQ. Human umbilical cord mesenchymal stem cells and the treatment of spinal cord injury. Chin Med J (Engl). 2009;122(2):225-231.

[29] Deans RJ, Moseley AB. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Exp Hematol. 2000;28(8):875-884.

[30] Wang HS, Hung SC, Peng ST et al. Mesenchymal Stem Cells in the Wharton’s Jelly of the Human Umbilical Cord. Stem Cells. 2004;22(7):1330-1337.

[31] Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, et al. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Human Reprod. 2004;19(6):1450-1456.

[32] Karahuseyinoglu S, Cinar O, Kilic E, et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys. Stem Cells. 2007;25(2):319-331.

[33] 沈亚文,王小华,孙巍.造血干细胞移植中单个核计数与CD34~+细胞计数的比较[J].中国医学工程,2013,21(01):96.

[34] Liu M, Yang SG, Liu PX, et al. Comparative study of in vitro hematopoietic supportive capability of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and umbilical cord. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 2009;17(5): 1294-1300.

引言

材料方法

设计：细胞学对比观察。

时间及地点：实验于2010年12月至2013年3月在新疆医科大学第一附属医院医学研究中心干细胞研究室完成

材料：3份人脐带间充质干细胞标本是来自正常孕足月行剖宫产术的产妇，在胎盘娩出后6 h内完成细胞分离，均经产妇或家属同意。抽取正常3人肝素钠抗凝骨髓血，取包皮环割手术后包皮，均征得供者同意并签署知情同意书。

比较冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力所用主要试剂与仪器：

实验方法：

脐带间充质干细胞的扩增：剪取脐带长8-15 cm，置入含青/链霉素各200 U/mL的PBS中浸泡15 min。用PBS反复涮洗直至为白色，将基质与脉管一同剪成碎块(1.0- 2.0 mm³)，用PBS洗涤2遍。将组织块分别置入10 cm 培养皿中，添加10 mL细胞培养生长液，置入37 ℃，饱和湿度，体积分数5%的CO₂培养箱中孵育4 d，首次半量换液，此后每3 d半量换液，细胞汇合达85%-90%时去除组织块传代。细胞的传代：吸弃培养液，PBS洗涤2遍，0.05%胰蛋白酶/0.53 mmol/L EDTA消化1-3 min，生长液中止消化，离心5 min，200×g，后弃去上清液，加生长液计数细胞数和细胞拒染率，调节细胞浓度，以8×10³/cm²的密度接种于10 cm培养皿中，为P1细胞，以后每3 d全量换液，直至细胞汇合达80%-90%再按上述方法传代，直至第3代。同时成功进行了冻存前、后人脐带间充质干细胞的成骨、成脂诱导进行鉴定。

人脐带间充质干细胞的冷冻和复苏：细胞扩增P1，汇合达80%-90%按上述方法消化细胞，加入冷冻液，调节细胞终浓度为1×10⁹ L^-¹，分装入冷冻管中，每管1 mL，置4 ℃ 1 h，-80 ℃过夜，次日放入液氮(-196 ℃)中，冷冻1个月。将冷冻细胞管置入37 ℃水浴中，融化后移入10 cm培养皿中，缓慢加入10 mL 37 ℃预温的细胞生长液，置入37 ℃、饱和湿度、体积分数为5%的CO₂孵育箱中孵育。按上述方法培养传代，直至第3代。

脐带间充质干细胞滋养层的制备：将P3人脐带间充质干细胞按1×10⁵/孔的浓度分别接种于6孔培养板上，细胞汇合达60%-70%时，2.5 g/L的丝裂霉素C处理24 h后原条件培养24 h后弃培养液，换用相应培养体系进行后续实验。

骨髓间充质干细胞培养和传代：抽取健康志愿者肝素抗凝新鲜骨髓血10 mL按Ma等^[22]的方法分离、培养传至P3代，流式标记其免疫表型，并按1×10⁵/孔的浓度分别接种于6孔培养板上，细胞汇合达60%-70%时，2.5 g/L的丝裂霉素C处理24 h后原条件培养24 h后弃培养液，作为阳性对照进行后续实验。

人包皮成纤维细胞滋养层的制备：取健康志愿者包皮环割手术后包皮，按Liu等^[23]描述的组织块培养法分离培养出人包皮成纤维细胞，扩增培养至P3代，并按上述制备人脐带间充质干细胞滋养层的方法制备人包皮成纤维细胞滋养层。

骨髓单个核细胞的获得：取健康志愿者肝素抗凝新鲜骨髓血10 mL，DMEM稀释后，离心10 min，2 500 r/min，半径16 mm，吸去脂肪层。PBS稀释骨髓血细胞沉淀约为10⁹ L^-¹，将血液按1.5∶1比例缓缓加于Ficoll分离液上层，离心30 min ，2 600 r/min，半径16 mm。用巴斯德吸管吸取分离液与血浆之间界面白膜层的单个核细胞，离心10 min，2 000 r/min，半径16 mm，弃上清，加PBS洗涤2次，加入生长液，计数并调节细胞浓度为1×10⁹ L^-¹。取1.5 mL EP管，加入上述细胞悬液1 mL，离心5 min，1 500 r/min，半径16 mm，洗涤两次，最后配制成0.5 mL细胞悬液，加入以PE标记，0.5 g/L的鼠抗人CD34单克隆抗体20 μL标记细胞， 4 ℃，孵育20 min，流式细胞术测定CD34细胞纯度。

细胞共培养及观察：将体外制备的人脐带间充质干细胞和骨髓间充质干细胞细胞滋养层进行实验分组。①空白组：无滋养层，单纯骨髓单个核细胞。②冷冻人脐带间充质干细胞组：冷冻后人脐带间充质干细胞加骨髓单个核细胞。③未冷冻人脐带间充质干细胞组：未冷冻人脐带间充质干细胞加骨髓单个核细胞。④骨髓间充质干细胞组：骨髓间充质干细胞加骨髓单个核细胞。⑤人包皮成纤维细胞组：骨髓单个核细胞加人包皮成纤维细胞。每组加入人骨髓单个核细胞1×10⁶个，滋养层每组设6个复孔。每周半量换液1次，分别于14，28，35 d收集各孔全部悬浮及贴壁细胞(用0.05%胰酶消化)：将上层细胞细胞悬液和0.05%胰酶消化的皿底层细胞消化1-3 min后终止反应后移至15 mL离心管中300×g室温离心5 min，加入生长液重悬，分别转移至新的孔板中，静止培养4 h，收集悬浮细胞，离心10 min，2 000 r/min，离心半径 16 mm，PBS重悬，取样计数活细胞，并按2.5×10⁵/孔细胞数加入甲基纤维素集落培养液，置入37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度下培养14 d，计数集落数。

主要观察指标：通过集落计数，评价各组滋养层细胞的造血支持能力。

统计学分析：应用SPSS 17.0医用统计软件包，采用配对样本t 检验分析和非参数秩和检验进行数据统计学处理，各组数值以x(_)±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

国内外已有许多关于在体外人脐带间充质干细胞支持骨髓或脐血造血干/祖细胞扩增的报道^[23-24]，由于人脐带间充质干细胞取材便捷，扩增容易，还具有修复和再生间充质病变组织的能力^[25]，相较于脂肪组织来源的间充质干细胞，人脐带间充质干细具有更强的增值能力及稳定性^[26]，因此，它是另一具有潜力的细胞治疗的来源^[27-29]。研究表明人脐带间充质干细胞与骨髓间充质干细胞有许多相似的生物学特性^[30]，Rahul等^[20]的研究表明即使是单一基质细胞作为滋养层也能够促进CD34⁺细胞增殖，同时维持其干细胞特性，可使集落数量比单用多种细胞因子组合者增加3-5倍，虽然短期低温保人脐带间充质干细胞群在结构和代谢方面能够耐受冷冻和融化^[31-32]，但冻存后人脐带间充质干细胞是否具有支持骨髓造血干/祖细胞体外扩增报道甚少。为此，课题比较研究了冷冻前后人脐带间充质干细胞对造血干/祖细胞的扩增作用，以期明确冷冻保存对人脐带间充质干细胞支持造血干/祖细胞作用的影响以及与骨髓间充质干细胞支持造血干/祖细胞相比的差异性，为将来临床用人脐带间充质干细胞替代骨髓间充质干细胞支持造血功能的治疗提供依据。

体外实验中多选择纯化的CD34⁺作为“种子”细胞接种在滋养层细胞上来观察基质细胞对其增殖的支持作用，但在临床应用中，移植到人体内的造血干细胞处在骨髓环境中，其中含有大量的基质细胞和其他非造血骨髓成分。研究选择的骨髓单个核细胞是一群混杂的细胞群，它的CD34阳性率是0.1%-6.6%，已有研究证实骨髓单个核细胞计数可代替CD34⁺作为造血干细胞移植中的造血细胞含量的指标^[33]。虽然骨髓单个核细胞中CD34⁺阳性率低，但经过体外5周长期培养后造血集落分析，仍有造血集落形成能力细胞存在，并显示出其在人脐带间充质干细胞滋养层上生长集落的优势，因此认为研究所用的骨髓单个核细胞是含有足够量的造血干/祖细胞。通过将骨髓单个核细胞与各组滋养层细胞共培养14，28，35 d，观察到了长期培养35 d后，体系中细胞与集落的变化过程：①发现冷冻人脐带间充质干细胞组与未冷冻组相比，只存在集落数量上的差异，大量单个透亮的细胞形态、集落形态、类型无差别。②与骨髓间充质干细胞组相比，冷冻人脐带间充质干细胞组无论大量单个透亮的细胞形态还是集落类型、大小以及数量差异无显著性；但未冷冻人脐带间充质干细组集落数多于骨髓间充质干细胞组，差异有显著性，这与Liu等^[34]的报道不一致。③与空白组和不具有支持造血干/祖细胞增殖作用的人包皮成纤维细胞组相比，无论集落大小、类型还是数量都存在显著差异。表明冻后人脐带间充质干细胞仍具有较好的造血支持能力，而与冷冻前相比存在明显差异，说明其造血支持作用有所减弱。

综上所述，冷冻复苏后的人脐带间充质干细胞对造血干/祖细胞的体外扩增作用虽然有所减弱但仍保持其较好的支持营养作用。研究实验标本数量较少，缺乏冷冻更长时间的观察，这是该项研究今后需继续完善的。

冷冻前后脐带间充质干细胞造血支持能力的比较

Human umbilical cord mesenchymal stem cells: Comparison of hematopoiesis supporting capacity before and after cryopreservation

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[2]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[3]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[4]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[5]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[6]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[7]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[8]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[9]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[10]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[11]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[12]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[13]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[14]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.
[15]	梁学奇, 郭黎姣, 陈贺捷, 武杰, 孙雅琪, 邢稚坤, 邹海亮, 陈雪玲, 吴向未. 泡状棘球绦虫原头蚴抑制骨髓间充质干细胞向成纤维细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 996-1001.